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葉綠素是光合作用中最重要的色素, 與光合性能和籽粒產量密切相關。關于作物葉綠素含量的遺傳分析, 在水稻、小麥、大麥、棉花和高粱等作物中都有研究報道, 主要結果集中在不同發育時期葉綠素含量的QTL 檢測, 也有高葉綠素含量基因的發掘。但是, 有關大豆葉綠素含量遺傳分析報道較少, 目前已檢測了鐵缺乏黃化的QTL和葉綠素缺乏的兩個基因座, 有關不同生育時期葉綠素含量QTL 檢測也只有崔世友等的報道。更重要地, 有關多環境條件下不同生育時期葉綠素含量的遺傳分析很少。為此, 本研究將開展不同環境條件下大豆不同生育時期葉綠素含量的遺傳研究, 解析其遺傳基礎。

本研究利用已構建的溧水中子黃豆×南農493-1組合244 株F2 群體150 個SSR 分子標記, 利用SPAD-502 葉綠素儀分別于2007 年和2008 年在南京農業大學江浦試驗站和臨沂市農業科學院試驗站測定了葉綠素含量13 次, 用復合區間作圖法分析了葉綠素含量的動態表達, 檢測到控制葉綠素含量的主效QTL, 并探討不同環境和不同生長時期下, 控制大豆葉綠素含量的QTL 的規律性, 為大豆高產育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

2005 年夏, 在南京農業大學江浦試驗站配制溧水中子黃豆(P1)×南農493-1(P2)雜種F1, 同年在海南南繁獲得F2 種子。2006 年夏, 在南京農業大學江浦試驗站種植F2 種子, 獲得244 株F2 群體。小區行長3 m, 行距50 cm, 株距10 cm。采用系譜法衍生F2:3和F2:4 家系群體。2007 年夏, 在南京農業大學江浦試驗站, 按每F2:3家系種植3 行小區, 完全隨機設計,小區行長2 m, 株距10 cm, 成熟時中間一行單獨收獲考種。2008 年夏, 在南京農業大學江浦試驗站和山東臨沂農業科學院試驗站, 按2007 年種植F2:3 家系方式種植F2:4 家系群體。

1.2 SSR 遺傳圖譜的構建

參照SSR 標記“大豆公共遺傳圖譜” 從大豆數據庫SoyBase (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得SSR 引物序列972 對, 由上海英駿生物技術有限公司合成。篩選出親本和F2 群體間有多態性的SSR引物150 對。

采用Saghai-Maroof 等[16]報道的CTAB 方法提取DNA。PCR 總體積為15 μL, 含模板DNA (20 ngμL–1) 5 μL, 10×PCR buffer [含200 mmol L–1 Tris-HCl(pH 8.4) 、200 mmol L–1 KCl 、100 mmol L–1(NH4)2SO4、15 mmol L–1 Mg2+] 1.5 μL, 10 mmol L–1dNTP 0.2 μL, 5 U μL–1 Taq 酶0.15 μL, 10 pmol 引物3μL, ddH2O 5.15 μL。PCR 程序為95℃預變性2 min;94℃變性30, 退火(不同引物退火溫度介于47~55℃之間) 45℃, 72℃延伸1 min, 35 個循環; 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺膠對擴增產物進行分離, 銀染檢測。

采用Joinmap 3.0 軟件包構建連鎖圖。用Group 命令, 以LOD 值大于3.0 進行人工分組, 每一個Group 可以采用不同的LOD 值標準, 然后選擇Calculate map 命令, 用Kosambi 作圖函數進行重組率與遺傳距離間轉換, 參考大豆公共遺傳圖譜整合染色體上標記。

1.3 葉綠素含量的測定

在苗期第7 片復葉展開時, 對親本及其每個F2衍生家系的中間行取生長正常單株的倒3 復葉功能葉的中間葉片, 每家系固定觀測5 株, 用日本產SPAD-502 型葉綠素計數儀測定每單株1 片葉的上、中、下3 點, 以平均值SPAD 值度量該葉片的葉綠素含量。

2007 年在江浦試驗站, 采用每周測量1 次的方式(24/7、30/7、5/8、11/8、17/8、23/8、29/8 和4/9,日/月), 從苗期到盛花期共測量8 次(數據集I)。2008年在江浦試驗站, 只在初花期(8 月8 日)測1 次(數據集II)。2008 年在臨沂農業科學院試驗站, 從苗期到初花期共測4 次(14/7、20/7、26/7 和1/8, 日/月)(數據集III)。

1.4 QTL 定位方法

利用Win QTL Cartographer v2.5 軟件包的復合區間作圖(composite interval mapping, CIM)分析數據集I~III, 以向前逐步回歸分析方法選擇協變量標記控制遺傳背景, 其他按標準設置。以LOD 值大于2.5 作為QTL 存在的閾值。用MapChart 2.2 將QTL 定位結果繪制成QTL圖。按照QTL+性狀+連鎖群+數字命名QTL, 其中QTL 以小寫q 開頭, 性狀以英文縮寫表示, 數字表示同一性狀在該連鎖群上檢測到的不同QTL 個數。

2 結果與分析

2.1 不同時間葉綠素含量的表型變異特征

從表1 可知, 溧水中子黃豆(P1)不同時間點葉綠素含量及其平均含量與南農493-1 都存在顯著差異;F2:3 和F2:4 家系間也存在遺傳變異, 呈偏態與非正態分布, 說明存在主效QTL 或QTL 與環境互作。

2.2 葉綠素含量QTL 的動態表達

用復合區間作圖法分析數據集I~III, 檢測到葉綠素含量共有20 個QTL, 結果見表2 和圖1。2007 年江浦試驗站的8 次測量中共檢測到10個QTL, 分布在6 個連鎖群上。第1~8 時間點分別檢測到3、0、2、2、1、1、1 和0 個QTL, 其中1~4時期共檢測到7 個QTL, 說明葉綠素合成基因在葉綠素合成前期表達較為活躍, 每個時期都有0~3 個QTL 控制葉綠素的合成; 在5~8 時期共檢測到3 個QTL, 說明葉綠素的后期合成相對要少一些, 這是因為這個時期已經是大豆的鼓粒期, 葉綠素的合成已達頂峰, 以后就逐漸分解。8 次檢測中, N 連鎖群上的satt234~satt022 有3 次被檢測到, 說明該區間可能存在控制葉綠素合成的基因; D1a 和F 連鎖群上在不同基因座上都檢測到2 次, 說明控制葉綠素合成的位點分布在不同的連鎖群上。從貢獻率上看, 大于10%的QTL 有5 個; qchl-N-1 在8 次測量中共出現3 次, 有兩次貢獻率較高, 分別達57%和10%。在2008 年臨沂試驗站的4 次測量中, 共檢測到6 個QTL, 分布在6 個不同的連鎖群上。第1~4 次分別檢測到2、2、1 和1 個QTL。各QTL 的位置均不相同。從貢獻率來看, 大于10%的有2 個; 最大貢獻率14%的QTL 是qchl-D2-2。

在2008 年江浦試驗站的1 次測量中, 共檢測到4 個QTL, 分布在4 個連鎖群上。雖然M 連鎖群satt463 標記兩側都存在QTL, 但是這兩個QTL 效應方向完全一樣, 很可能是一個QTL, 為此只列出LOD 較大的qchl-M-1。從貢獻率來看, 大于10%的是qchl-D1a-1, 為30%。

在3 個數據集的QTL 檢測中, QTL 在N 連鎖群上出現了4 次, 在F、D1a 和M 連鎖群上出現了3次, 在K 連鎖群上出現了2 次, 說明這幾個連鎖群可能是葉綠素合成基因的位置所在。同一地點(江浦)的不同年份間只檢測到1 個共同的QTL, 即位于sat_160~satt147 間的qchl-D1a-1。江浦和臨沂兩地點間共同檢測到1 個QTL, 位于K 連鎖群上的qchl-K;相連鎖的QTL 有2 個, 分別位于M 和N 連鎖群。從上述結果看, 不同時期檢測到的葉綠素含量QTL 多不相同, 共同QTL 比例較低, 說明多數基因的表達是分階段的、動態的。但也有的基因表達是幾個時期都進行的, 控制葉綠素含量的基因是多條染色體的多個QTL, 如qchl-N-1。

3 討論

本文的葉綠素含量QTL 定位結果具有一定的可靠性, 表現在三方面：(1) 在同一地點(江浦)的不同年份(2007 和2008 年)間、江浦和臨沂不同地點間都檢測到相同的QTL, 如qchl-D1a-1; (2) 與他人的研究結果相對一致, 例如, 與崔世友等利用二年一地數據定位的葉綠素QTL 相比較, 與D1a、G 和M連鎖群上satt147、satt688 和sat_391– satt150 標記連鎖的QTL 是一致的, 與C2、M 和F 連鎖群上的QTL是相近的; Lin 等檢測的鐵缺乏黃化葉綠素含量QTL 位于N 連鎖群上, 這與本文在2007 年江浦試驗站的8 次的檢測結果中N連鎖群上satt234–satt022的QTL 出現3 次的結果一致; (3) 葉綠素含量QTL與大豆光氧化QTL[23]比較, 有約70%的QTL 是連鎖的, 而粒形性狀QTL[24]的比例少得多(表3)。Fanizza 等認為SPAD 值能反映葉片實際葉綠素含量, 類似的研究還有較多, 如Ma 等。說明本文用SPAD 值反映植株功能葉片葉綠素含量是可行的。目前, 多數QTL 定位的研究都只局限于植株數量性狀某一時間點的表現, 無法掌握不同發育時期各QTL 的效應大小和基因作用方向。為此, 需要從動態角度探索作物復雜性狀的遺傳學基礎。實際上, 數量性狀的遺傳表達與發育階段密切相關,存在基因表達的發育階段性, 不同發育階段的性狀變化是基因的選擇性有序表達的結果。數量性狀受特定的微效多基因系統控制, 對數量性狀在發育不同時段的基因表達和效應進行研究, 有助于揭示數量性狀發育的分子遺傳機理, 其研究結果對分子

標記輔助選擇育種實踐具有重要的指導意義。迄今為止, 已在水稻、玉米、小麥和大豆

等作物上, 從動態角度剖析了株高和分蘗等復雜性狀的遺傳學基礎。但是, 針對葉綠素含量遺傳機制的動態分析還比較少, 特別是大豆葉綠素含量。從本文結果看, 不同時間點檢測到的葉綠素含量QTL差異較大, 共同的QTL 不多(N 連鎖群除外)。這與曹樹青等的結果相似。筆者認為, 植物體內的葉綠素不斷地進行新陳代謝, 有合成也有降解, 葉綠素的生物合成是比較復雜的, 同時, 光照、溫度、營養元素、氧、水分等也影響葉綠素形成。所以, 控制葉綠素含量的表達在時空上應該存在差異。這也說明葉綠素含量的遺傳機制是十分復雜的, 還需要進一步剖析。

4 結論

兩環境8 個發育時期共檢測到20 個與葉綠素含量相關的QTL, 雖然不同發育時期間、年份間和地點間共同的QTL 較少, 但是在N、D1a、F 和K 連鎖群上仍有重復出現3~4 次的QTL, 如D1a 連鎖群上分子標記sat_160 和satt147 間的qchl-D1a-1。