利用葉綠素測量儀研究桑葉的葉綠素含量
葉綠素是植物吸收光能進行光合作用的重要物質基礎，它直接參與光能的吸收、傳遞、分配和轉化等過程，其含量的大小以及a/b的相對比值不僅可以反映植物的生長發育狀況、生理代謝水平及營養條件，還可作為環境生理研究的重要參考指標[1]。因此，對其含量及a/b比值進行測定與分析一直是植物生理學研究的重點內容。
葉綠素是脂溶性卟啉類化合物，在分子結構上，葉綠素由脫鎂卟啉環、葉綠酸、葉綠醇、甲醇和二價鎂離子等部分構成，各葉綠素結構之間的差別很小，葉綠素a和b僅在吡咯環Ⅱ上的附加基團不同：前者是甲基，后者是甲醛基；在光學特性上，葉綠素a和b及其衍生物對紅光區(620~700 nm)和藍紫光區(400~500 nm)的光吸收特別強烈；而對綠光區(520~580 nm)的光則吸收較弱，因而葉綠素呈現綠色。
目前，葉綠素的提取方法主要有有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、吸附樹脂萃取法、超聲波萃取法和微波萃取法等。其中微波輔助萃取法和超臨界CO2萃取法由于能夠大大降低提取時間，并減少萃取溶劑的使用量，逐漸受到人們的關注，但超臨界CO2萃取法受操作復雜、設備昂貴、成本較高等因素的困擾，其應用領域也受到限制。有機溶劑萃取法有直接利用葉綠素易溶于有機溶劑的特點，選用合適的有機溶劑進行萃取，并輔助了微波、超聲波或離子交換分離等手段來提高效率和純度。因此，有機溶劑萃取法是最常用的葉綠素提取的常規方法。葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、葉綠素測量儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等，其中分光光度法具有準確度高的特點，是葉綠素含量測定過程中應用最為廣泛的方法。
筆者擬采用有機溶劑萃取法從桑葉中提取葉綠素，并利用分光光度法對葉綠素含量進行測定，通過分析不同節位桑葉及桑葉不同部位的葉綠素含量，探討桑葉葉綠素的光譜特征及其含量的變化規律，以期為桑葉葉綠素的提取及含量測定提供方法性參考，并為桑葉葉綠素的進一步研究提供參考數據。
1材料與方法：
1.1材料
1.1.1試驗材料：桑葉，采自中國農業科學院蠶業研究所國家種質鎮江桑樹圃。
1.1.2主要試劑：試驗所用試劑均為分析純。
1.1.3主要儀器：UV-9100型紫外-可見分光光度計，由浙江托普分析儀器有限公司生產；電熱恒溫水浴鍋，由杭州麥哲儀器設備廠生產；YP5001型電子天平，由浙江托普儀器廠生產；打孔器(d=0. 6 cm)。
1.2方法：
1.2.1葉綠素的提取含量測定方法。將采集到的新鮮桑葉帶回實驗室洗凈、擦干后，用直徑為0.6 cm的打孔器打成小圓片；選取5片稱重，然后用6ml有機溶劑在暗室浸提24 h；于5 000 r/min離心機中離心5min，取上清液置于光徑為1.0 cm的比色皿中，用紫外-可見分光光度計測定其吸光值，并利用Arnon法的修正公式對其葉綠素含量進行計算，分析桑葉葉綠素的光譜特征，進而比較研究不同節位桑葉和桑葉不同部位葉綠素含量的變化規律，綠素含量用Arnon法的修正公式進行計算：
其中，V為萃取溶劑體積(ml)；S為表面積(cm2)，通過樣品個數(5片)與打孔器面積(d=0.6 cm)之積進行計算；Ca為葉綠素a含量，Cb為葉綠素b含量，Ca+b為葉綠素a和b的含量之和；A645、A663分別代表在波長為645 nm和663 nm下的吸光度值，所有試驗均重復3次。
1.2.2 桑葉葉綠素光譜特征分析。用紫外-可見分光光度計在360~700 nm的波長范圍內，測定不同波長條件下，桑葉葉綠素的吸光度值，繪制桑葉葉綠素的光譜圖。
2結果與分析：
2.1桑葉葉綠素的光譜特征：
通過測定不同波長條件下桑葉葉綠素的含量，繪制出其光譜圖(圖1)，由圖1可知：在試驗范圍內，桑葉葉綠素有2個強吸收帶，分別為400~460 nm和640~680 nm，其中400~460 nm為藍紫光區，吸收最高峰出現在432 nm處，而640~680 nm是紅光區，且在662 nm處出現最高吸收峰，這是由于葉綠素中的葉綠素a和葉綠素b分別在這2個波長處吸收最強，所得結果與其他高等植物葉片中葉綠素的吸收光譜圖基本一致。
2.2不同節位桑葉的葉綠素含量測定結果：
因所受光照強度不同、老嫩程度不一，不同節位桑葉的葉綠素含量也會有所不同。該研究采集第2、12和22節的桑葉(從底部到頂端依次排序)，用有機溶劑萃取法和分光光度法測定不同節位桑葉的葉綠素含量，并分析其變化規律，結果如圖2所示。由圖2可知，第12節桑葉中葉綠素含量最高，但葉綠素a/b的比值最低，為1.55；第2節桑葉中葉綠素含量稍低，葉綠素a/b比值為2.54；而第22節桑葉中葉綠素含量最少，但葉綠素a/b比值為2.46，與第2節桑葉的葉綠素a/b比值幾乎相等。
一般來說，上部葉片最嫩，中部次之，下部最老，且植物的氮素營養是從成熟葉片向幼嫩葉片轉運，葉綠素含量成熟葉應多于幼嫩葉。根據此理論，下部葉片中葉綠素含量應最高，這與該研究結果有差異，之所以會出現這樣的現象，一方面可能是由于葉片所受光照強度不同引起的。中部葉片所受光照較下部葉片強烈，且從葉綠素a/b的比值也可以看出，中部葉片的葉綠素a/b最低，即葉綠素b的含量最高，說明桑樹中部葉片最耐陰，較低的光強即可刺激葉片進行強烈的光合作用，這也是桑樹進行光合作用的主要來源。上部葉片最嫩，雖然接受光強最強，但由于植物本身的生理特征決定了上部葉片的葉綠素含量最低。另一方面可能是由試驗誤差引起的差異。從試驗結果可知，中部葉片葉綠素含量的測定結果的誤差最大，引起該誤差的因素有很多，這也是造成結果不一的1個因素。
2.3 桑葉不同部位的葉綠素含量測定結果：
一片桑葉因不同的光照強度、營養狀況及生理條件間的細微差別，會導致桑葉不同部位中葉綠素含量也有差異。該研究將桑葉分為3部分，即葉尖、葉中和葉柄，分別測定不同部位的葉綠素含量，結果如圖3所示。
由圖3可知，靠近葉柄處葉綠素含量明顯高于其他部位，葉綠素含量高低順序為葉柄處(葉中部(葉尖部，呈現出下部葉位大于上部葉位的規律。這可能是因為植物的氮素營養是從成熟葉片向幼嫩葉片轉運，葉綠素含量成熟葉多于幼嫩葉，使桑樹葉片葉色隨之發生相應變化而導致吸光值的不同。此外，葉尖部的葉綠素a/b比值最低，葉柄處的最高，葉中部其次，說明桑葉葉尖部最耐陰，葉綠素b含量較高，可適應陰生生境，而葉柄部相對最不耐陰。
3結論與討論：
對葉綠素進行準確測定是植物生理學的重點研究內容，葉綠素a和b含量的多少直接影響光合速率的大小，葉綠素a/b值也能反映一定的光合速率， a/b值高，光合活性也高，光合活性高，植物就具有較高的光合速率。試驗結果表明：
①桑葉葉綠素光譜特征與其他高等植物葉綠素的光譜特征類似，可采用Arnon法的修正公式對葉綠素含量進行計算。
②中間節位的桑葉中葉綠素含量最高，但其葉綠素a/b的比值卻最小，雖然該結果存在一定爭議，但從葉綠素含量來看，桑樹光合作用的葉綠素主要來源是中部節位的葉片。
③對同一片葉子而言，因光照強度、營養狀況和生理條件的不同，不同部位葉片的葉綠素含量會有所不同，該研究結果證實了這一點。研究發現，葉柄處的葉綠素含量最高， a/b值也最高，說明在葉柄處的光合速率最高，且由于葉綠素b的含量較低，說明葉柄處較適應陽性生境，而葉尖處與其正好相反。
試驗僅對桑葉中葉綠素的光譜特征及其含量的變化規律進行了初步探討，該結果為葉綠素的進一步研究提供了必要的參考依據和數據支持。
